LES CULTURES IN VITRO VEGETALES





Que sont les cultures in vitro de plantes ? Comment procède t-on ? Quelles sont les différentes techniques utilisées ? A quoi servent elles ? Ces techniques sont elles utilisées à grande échelle? Dans quels pays ? Autant de questions qui trouveront en partie réponses dans cette page.

Dans les programmes classiques d'amélioration des plantes, pour créer une nouvelle variété il faut compter de 8 à 15 ans selon l'espèce. C'est très long, d'autant que les objectifs de sélection peuvent évoluer avec le temps: goût du consommateur, contraintes industrielles, besoins du marché, maladies etc.

Les techniques de culture in vitro sont des outils qui peuvent aider l'obtenteur de plantes à différents niveaux de son programme d'amélioration, notamment pour réduire les délais de mise sur le marché des nouveaux cultivars, mais aussi pour assainir les variétés, les conserver et réduire les coûts de production.

DEFINITION


Les cultures in vitro végétales sont des cultures d' explants de plantes, sur un milieu synthétique, dans des conditions stériles, dans un environnement contrôlé et dans unespace réduit.

Les explants peuvent être des parties d'organes ou des organes entiers, (tige, feuille, racine, fleurs, etc.), des tissus, des pièces florales, des graines ou des embryons, des bourgeons ou des apex ou des méristèmes, des cellules somatiques ou sexuelles, des protoplastes. Le choix de l'explant sera fonction de la technique utilisée, de l'objectif et de l'espèce travaillée.

Le milieu synthétique est adapté dans sa composition à la technique, l'explant,
l'objectif et l'espèce, voire le cultivar. Il est en général composé d'eau, de macro et de micro-éléments, (sels minéraux), de substances de croissance: phytohormones et vitamines, de sucre et d'un agent gélifiant pour les milieux solides. Le pH est ajusté le plus souvent entre 5 et 6. On modifie le milieu au cours des différentes étapes de production, on doit utiliser un milieu neuf toutes les 3 ou 4 semaines en général.

Les conditions stériles sont obtenues par une désinfection des explants, une stérilisation du milieu de culture et des flacons ou tubes de culture. Les différentes opérations de mise en culture sont réalisées dans un environnement stérile obtenu par une hotte à flux laminaire horizontal: de l'air stérile est propulsé vers le vitroculteur.Les conditions stériles sont primordiales à obtenir afin qu'aucun champignon ou bactérie ne viennent coloniser les milieux de culture, très favorables à leur prolifération, sous peine de nécrose de l'explant.


L'environnement contrôlé concerne notamment deux paramètres: la température de culture, et l'éclairement: intensité et longueur du jour. Ils sont obtenus artificiellement. Leurs valeurs dépendent de l'espèce travaillée ainsi que de la technique utilisée.


L'espace est réduit car les plantes sont miniaturisées, cultivées dans des récipients tenant sur des étagères éclairées, ce qui permet d'avoir la possibilité de replanter des hectares de terrain à partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés. On peut également conserver d'innombrables variétés à l'abri des parasites et indéfiniment sur une petite surface au sol.

PROPRIETES

Les techniques de culture in vitro végétales utilisent la propriété de totipotence des cellules végétales mise en évidence en 1902 par Haberlandt :en théorie il est possible de régénérer une plante entière à partir de n'importe quelle cellule d'une plante donneuse. Cette propriété s'exprime dans la nature et est exploitée depuis la nuit des temps dans les phénomènes de bouturage, drageonnage, marcottage etc.


TECHNIQUES


Les différentes techniques de culture in vitro végétales que nous utilisons au laboratoire TECHNIVITsont:

la micropropagation , la culture de méristèmes, l'embryogenèse somatique, l'haplo-diploïdisationpar androgenèse ou gynogenèse, la création de variants, le sauvetage d'embryons immatures issus de croisements interspécifiques par exemple.

D'autres techniques existent : la culture de cellules et la production de métabolites secondaires, la bio-encapsulation et la production de semences artificielles, la cryo-conservation à -196°C, la culture de protoplastes et la fusion somatique, la transformation génétique.


En général il y a 4 étapes de culture:


- l'initiatation ou la mise en place des cultures (la plus délicate et difficile)


- la multiplication


- l'enracinement


- le sevrage ou acclimatation

APPLICATIONS

Aujourd'hui, de nombreuses espèces sont concernées par l'utilisation des cultures in vitro, tant au niveau de l'élaboration de nouvelles variétés qu'au niveau de la production des plants, et des centaines de millions de plantes in vitro sont acclimatées annuellement dans le monde dans la plupart des pays y compris dans ceux en voie de développement.. On estime à plus de 300 espèces de plantes qui sont multipliées in vitro de façon industrielle.



Certaines plantes vertes sont multipliées uniquement par in vitro. De nombreuses variétés de plantes horticoles et maraîchères de grand intérêt, anciennes ou nouvelles, ont étésauvées de la menace de disparition, car virosées, par culture de méristèmes. Aujourd'hui, la culture des orchidées s'est "démocratisée", grâce à la culture in vitro, on peut trouver dans le commerce des plantes carnivores protégées car elles sont multipliées in vitro.


On a créé des banques de conservation , par culture in vitro, des variétés anciennes et menacées de disparition. C'est un moyen de sauvegarder la biodiversité des espèces sauvages et les espèces rares ou difficiles à multiplier naturellement (peu de graines ou de rejets).


Enfin, les cultures in vitro permettent de mettre plus rapidement sur le marché les plants certifiés, les nouvelles créations, ou encore d'assainir des collections.

LES TECHNIQUES DE CULTURE IN VITRO

LA MICROPROPAGATION in vitro ou le CLONAGE végétal


Définition et technique



Les plantes se reproduisent par la voie sexuée via les graines, mais elles utilisent pour certainesaussi une autre voie, celle de la multiplication végétative. La particularité de cette reproduction est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques génétiquement à la plante mère: c'est le clonage végétal ou multiplication conforme qui est exploitée depuis des siècles par les horticulteurs et jardiniers : bouturage, marcottage, greffage etc.


La micropropagation in vitro dérive de ce phénomène naturel. On cultive des explants végétaux stérilement, sur un milieu artificiel et dans un environnement contrôlé. Suite aux subcultures successives on obtient alors des plantes identiques à la plante de départ et que l'on peut multiplier à l'infini. On exploite ainsi la propriété de totipotence des cellules végétales.

Objectif


Il s'agit de produire en grande quantité des cultivars d'intérêt horticole, sylvicole, ou agronomique qui viennent d'être créés ou découverts ou qui ont toujours un intérêt.


Il peut s'agir également de plantes difficiles à reproduire naturellement.

Avantages


Les plantes obtenues sont génétiquement identiques à la plante ou variété de départ

La puissance de multiplication du clonage in vitro permet une production d'un grand nombre de plantes génétiquement homogènes en un laps de temps court. En 1 an, on peut produireen théorie plus de 4 millions de plants d'œillets à partir d'un seul apex, ou encore 50 000 plants de framboisiers alors que traditionnellement on en obtient 50.

Les plantes obtenues sont de qualité car en très bon état sanitaire, avec un enracinement régulier, des ramifications nombreuses, donc une vigueur accrue.


Le volume de plantes nécessaire à la mise sur le marché des nouvelles variétés est plusrapidement atteint.



La production de plantes in vitro permet de s'affranchir des saisons. Les cultures peuvent être ainsi programmées afin d'utiliser rationnellement les surfaces de serres.


La réduction du nombre de pieds mères nécessaire à la production de boutures permet un gain de place dans les serres d'où une économie d'énergie.


Pour les espèces fruitières ou ornementales, en multipliant in vitro, il est possible des'affranchir des portes-greffes. Ainsi les arbres ou arbustes obtenus ne présenteront pas de problème de rejet de "sauvageon".


Le micro bouturage permet de multiplier des espèces difficiles à reproduire naturellementtelles les orchidées d'où une diminution du coût de production. En faisant germer les graines d'orchidées in vitro , la présence des champignons symbiotiques est inutile.


La culture in vitro permet de multiplier des plantes stériles


Il est possible de conserver des variétés anciennes à l'abri des parasites et pathogènes, dans un espace réduit dû à la miniaturisation des vitroplants: plus de 1 000 plants/m2.


On peut reboiser très rapidement des plantations qui pourraient être ravagées par des parasites ou des catastrophes naturelles.


Les vitroplants sont très facilement transportables d'un pays à l'autresans risques sanitaires

Inconvénients

Le coût du plant in vitro est plus élevé que celui d'une bouture obtenue classiquement, il demande une main-d'œuvre spécialisée qui représente environ 60% à 70 % du prix de revient car l'automatisation est limitée.

Applications

Des centaines de millions de plantes issues de micro bouturage sont produites annuellement dans le monde, dans un nombre toujours grandissant d'espèces. Plus de 300 espèces seraient concernées par la multiplication in vitro à l'échelle industrielle.

LA CULTURE de MERISTEMES ou l'élimination de virus

Définition

Les méristèmes sont des zones de cellules à divisions intenses, situés au cœur des bourgeons et des extrémités de racines et à l'origine des tiges feuillées ou du système racinaire.


En 1950, les travaux de Limasset et Cornuet ont montré que les méristèmes étaientindemnes de virus.

Technique



La culture de méristème est une culture aseptique sur milieu artificieldu dôme apical sans ébauche foliaire. Il mesure 0,2 à 0,3 mm de côté et la dissection se fait sous loupe binoculaire. La technique peut être associée à de la thermothérapie: culture à température élevée, pour favoriser l'élimination des virus.

Objectif


C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

Avantages



La culture de méristèmes permet le sauvetage des variétés menacées d
e disparition car très virosées. Elle concerne essentiellement les plantes à reproduction par voie végétative: bouturage, marcottage, etc. tels le Pelargonium, le dahlia, le chrysanthème, la pomme de terre, l'artichaut, le fraisier, framboisier, etc. car cette voie favorise la transmission des virus à la descendance.


Les plantes produites sont saines: sans virus, champignons et bactéries et répondent auxnormes phytosanitaires d'échanges internationaux de plus en plus draconiennes.


Les plantes assainies ont une vigueur accrue, et des qualités de floraison et de fructification restaurées.


On obtient des variétés conformes à la variété d'origine et que l'on peut multiplier en grande quantité, la production est homogène.


Limites



Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues résistantes aux virus. Elles peuvent être recontaminées via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas prises.

Pour certaines variétés qui présentent des chimères:plantes panachées de Petunia ou de Pelargonium par exemple, par culture de méristèmes il est possible de ne pas retrouver à la régénération ce caractère horticole.


Applications



De nombreuses variétés de diverses espèces ont été sauvegardées grâce à cette technique: pomme de terre (Belle de Fontenay en 1954), dahlias, fraisiers, vigne, iris, framboisiers etc.

La Violette de Toulouse a été sauvée du déclin grâce à la culture de méristèmes qui a permis de régénérer des plantes sans virus.



Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels lePelargonium, le chrysanthème etc. sont produites à partir de pieds mères qui ont été assainis par culture de méristèmes. Il en est de même pour des espèces maraîchères tel l'artichaut ou encore le fraisier.

L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE

Définition


L'embryogenèse somatique est une forme de multiplication végétative qui permet d'obtenir une multitude de plantules identiques génétiquement à la plante donneuse d'explants.


C'est l'obtention d'embryons à partir de cellules somatiques, c'est à dire non sexuelles.

Technique

De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoquées à partir des tissus cultivés grâce à l'apport d'une forte dose d'auxine. Un cal est alors obtenu, c'est à dire un amas de cellules indifférenciées, rejuvénilisées et qui pourront donner naissance à des embryons bipolaires qui vont se comporter comme des embryons zygotiques, (issus de la fécondation entre une cellule sexuelle femelle et une cellule sexuelle mâle).

Applications

L'embryogenèse somatique est une technique qui s'adapte bien à la production industrielle.Les embryons somatiques peuvent être initiés dans des bioréacteurs, afin soit de produire dessemences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif, ou encore pour la synthèse demétabolites secondaires utilisés dans des médicaments, colorants, etc. Ce peut-être également un moyen de cloner des ligneux.

Embryon somatique de caféier

Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers, voire des millions d'embryons somatiques.

C'est une technique qui s'applique bien au fenouil, au caféier, au citronnier, à la luzerne, à la carotte, au pétunia, à l'aubergine, au cacaoyer, à l'hévéa, au palmier à huile, etc.

Avantages

Cette technique de multiplication s'adapte à l'automatisation, ce qui permet de réduire les coûts de production.


Le rendement en plantes produites est très élevé.


Les embryons obtenus sont d'origine unicellulaire, il n'y a donc pas de problème de chimères


L'embryogenèse somatique permet la rejuvénation des tissus ainsi qu'un accès aux transformations génétiques.


C'est un bon moyen pour produire des clones d'individus élites chez les ligneux.

Limites


Le passage par cal peut amener des risques de dérive génétique, c'est à dire d'obtention devariants qui seraient différents de la plante de départ.

L'HAPLO-DIPLOÏDISATION ou la création de lignées pures


Les plantes haploïdes sont issues d'une cellule sexuelle mâle ou d'une cellule sexuelle femelle sans fécondation. Les plantes obtenues n'ont qu'un seul lot de chromosomes au lieu de 2 normalement, qui est doublé naturellement ou artificiellement afin qu'elles deviennent fertiles.


Elles peuvent être obtenues par androgenèse, par gynogenèse, par fécondation avec du pollen irradié ou par croisements interspécifiques.


Il existe dans la nature à des pourcentages très faibles des plantes haploïdes, non issues de fécondation normale.

L' ANDROGENESE ou les plantes "sans mère"

Technique


C'est la régénération de plantes entières à partir de culture de cellules sexuelles mâles: des grains de pollen immatures, soit par culture de pollen isolé, soit par culture d'anthères.

Objectif


Obtenir des plantes haploïdes doublées, (après doublement spontané ou artificiel parcolchicine). Ainsi des lignées pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 à 10 ans par technique classique d'autofécondations.


L'obtention de lignées pures est une étape presque toujours nécessaire des programmes d'amélioration des plantes.
Illustration : Androgenèse du blé tendre









Culture des anthères, puis au bout de 1 à 2 mois les embryons androgénétiques sortent des anthères






Les embryons sont repiqués et forment des plantules, certaines sont albinos







Les plantules sont acclimatées après doublement artificiel du nombre de chromosomesavec de la colchicine. Puis les plantes haploïdes doublées sont cultivées en plein champ

Applications

C'est une technique utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le tabac, le maïs, l'asperge, le piment, etc. et en routine chez le colza, l'orge et l'aubergine.


Le blé Florin a été la première variété issue d'androgenèse inscrite au catalogue français. Ce fut une première mondiale initiée par le laboratoire d'Amélioration des Plantes d'Orsay. Aujourd'hui de nombreux cultivars de diverses espèces et issus de ces techniques d'haplo-diploïdisation sont déposés chaque année.

Avantages

Cette technique amène un important gain de temps, ce qui permet de mettre plus rapidement sur le marché de nouvelles variétés présentant des avantages pour l'agriculteur, l'industriel ou le consommateur. En effet une plante homozygote est directement obtenue, ce qui évite de faire une dizaine de générations d'autofécondations pour obtenir une lignée pure, état nécessaire aux programmes de sélection végétale.

Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes, cela permet de dévoiler des caractères intéressants par l'expression des allèles récessifs habituellement cachés. Ces gènes pouvant être exploités éventuellement.

Des recombinants intéressants peuvent ainsi être détectés et exploités, une résistance à une maladie par exemple.

Limites

Le rendement, (nombre de plantes viables/100 anthères cultivées) est souvent dépendant du cultivar.

Certaines variétés de céréales produisent un grand nombre de plantes albinos, donc non viables.

La GYNOGENESE ou les plantes "sans père"

Technique



On cultive des ovules ou des ovaires non fécondés, le plus souvent immatures, sur un milieu artificiel. On obtient des plantules ayant un seul stock de chromosomes.

Embryon émergeant d'un ovule de betterave non fécondé
Objectif

L'objectif est le même que pour l'androgenèse. Mais la gynogenèse est souvent utilisée chez les espèces qui sont récalcitrantes à l'androgenèse
Avantages





Par rapport à l'androgenèse, les risques d'obtention de plantes albinos sont fortement diminués voire nuls.
Applications


C'est une technique utilisée chez la betterave sucrière, le gerbéra, le riz, la laitue, la pastèque, le pommier, le triticale, le tournesol, etc.

Les autres techniques de gynogenèse:

Les croisements interspécifiques

En fécondant un ovule avec du pollen d'une autre espèce, souvent sauvage et proche, il y a développement d'un embryon mais élimination des chromosomes de l'espèce sauvage. La plantule qui se développe est haploïde.


C'est une technique largement utilisée chez l'orge, (Hordeum vulgare X Hordeum bulbosum), mais également chez le blé et la pomme de terre (Solanum tuberosum X Solanum phureja).

Pollinisation avec du pollen irradié

Irradier du pollen le rend inactif mais néanmoins capable d'initier des divisions cellulaires de l'ovule. Ceci permet l'obtention d'une plantule sans fécondation donc également avec le seul lot de chromosomes maternels.


Les fruits qui se développent, par parthénogenèse , n'ont pas de graines ou de pépins. Ce qui est intéressant pour le melon ou la pastèque par exemple.


Cette technique est utilisée chez le melon, le pétunia, l'asperge, l'oignon, la pastèque.

CREATION de VARIABILITE

Les mutations conduisent à la création d'un nombre croissant de nouvelles variétés: plus de 2 000 variétés ont été créées à partir de mutations naturelles ou induites.


Beaucoup de mutations apparaissent naturellement, si certaines sont létales, d'autres peuvent être mises à profit par l'obtenteur ou le producteur et de nouveaux types apparaissent:nectarine, cerisier auto-fertile, chou-fleur, betterave monogerme (évitant le démariage), colza sans acide érucique (huile ainsi non toxique), fruit de pamplemousse sans pépin ou à pulpe rose, etc.


En amélioration des espèces florales, fruitières ou maraîchères notamment, on peut avoir recours à la mutation induite par le biais de diverses techniques pour en augmenter la fréquence:
Techniques

Les radiations ionisantes

C'est la source principale de création de mutants. Ces mutants ne donnent pas toujours directement de nouvelles variétés, mais les plantes obtenues peuvent être des géniteurs qui entrent dans un programme de croisements.

La mutagenèse chimique

Des produits mutagènes inclus dans les milieux de culture peuvent induire des mutations intéressantes au niveau horticole ou agronomique.

La variation somaclonale ou les vitrovariants

Le passage par cal ou le nombre de cycles de culture in vitro sont des facteurs qui peuvent induire des variants, c'est à dire des plantes dont le génome est sensiblement différent de celui de la plante de départ. Il est possible de créer de la variabilité via les cultures cellulaires également, cette voie est explorée chez l'asperge par exemple. Pour cela on introduit des pressions de sélection tels le froid, des toxines, de la salinité et au moment de la régénération on peut obtenir des plantes nouvelles qui peuvent être résistantes au sel, à la sécheresse, à des maladies, etc., et que l'on n'aurait pas pu obtenir par une autre façon. Ces variants peuvent entrer dans des programmes de sélection, le Pelargonium "Velvet Rose" a été obtenu ainsi.
Applications

Des mutants ont été créés par exemple chez les céréales. On a pu créer par mutagenèse un colza avec une meilleure résistance à l'alternaria, (une maladie fongique).

Pour de nombreuses espèces cultivées: tabac, tomate, céleri, canne à sucre, fenouil, laitue, etc. des variations somaclonales ont amené de nouveaux caractères intéressants: résistance aux maladies, précocité de floraison, couleur et forme des fleurs, accroissement de vigueur.

Les mutations naturelles peuvent également être exploitées pour créer de nouvelles variétés.

Limites


Les modifications apparaissent aléatoirement sur les chromosomes et la proportion de mutants présentant un intérêt horticole ou agronomique est faible.




                                                                         Source : fr.wikipedia.org

                                                                                            TECHNIVIT Laboratoire